HPLC液相色譜常見問題及故障排除
第一章、簡要說明及一些必要的提示
當您遇到問題時，我們需要先判斷問題出在什么地方，最好的方法就是排除法，在其他條件不變的情況下，改變其中一個條件，如果問題依然沒有改變，則問題不是出在改變了條件的部分，然后再一個一個改變其他條件，直到找出可以影響問題結(jié)果的所有條件為止。
接下來，再看看這些對結(jié)果有影響的條件，有哪些條件是可以做適當調(diào)整的，然后再慢慢調(diào)整，直到得到滿意的結(jié)果為止。
如果以上方法不能得到滿意的結(jié)果，您就可能需要完全的更換某些條件，比如更換色譜柱，更換保護柱，更換接頭，更換溶劑等等。
本手冊將從四個方面列出一些液相色譜中常見的問題，并對可能的原因一一分析，最后給出解決方法。這四個方面如下：
? 1.壓力異常
? 2.漏液
? 3.譜圖問題
? 4.進樣閥問題
預(yù)防措施
許多液相色譜的故障是可以通過日常維護避免的，例如：定期的更換柱塞桿密封可 以避免柱塞密封的磨損以及由此產(chǎn)生的相關(guān)的故障。第六章列出了很多液相色譜的常見故障以及預(yù)防措施及建議。您需要針對您的色譜儀器類型靈活調(diào)整這些建議并使之成為實驗室日常維護工作的一部份。
第二章、常見問題之壓力異常
操作壓力的變化往往是故障的征兆，從下列原因中找出最接近的現(xiàn)象，并在右側(cè)的 列表中找出相應(yīng)的解決方法。
- 沒有壓力顯示，沒有流動相流動??????????????????????????????????表1
| 原因 | 解決辦法 |
| 電源問題 | 接通電源、開機 |
| 保險絲被燒壞 | 更換保險絲 |
| 控制器設(shè)定不正確或設(shè)定失敗 | a. 采取恰當?shù)脑O(shè)定b. 修理或更換控制器 |
| 柱塞桿折斷 | 更換柱塞桿 |
| 泵頭內(nèi)有空氣 | 溶劑脫氣、啟動泵抽出空氣 |
| 流動相不足 | a. 補充流動相b. ? 更換入口篩板 |
| 單向閥損壞 | 更換單向閥 |
| 漏液 | 擰緊或更換手緊接頭 |
?
- 流動相流動正常，但沒有壓力顯示????????????????????????????????表2
| 原因 | 解決方法 |
| 儀表損壞 | 更換儀表 |
| 壓力傳感器損壞 | 更換壓力傳感器 |
?
C、壓力持續(xù)偏高??????????????????????????????????????????????????表3
| 原因 | 解決方法 |
| 流速設(shè)定過高 | 調(diào)整流速設(shè)定 |
| 柱前篩板堵塞 | a. 在允許情況下反沖色譜柱b. 更換篩板*
c. 更換色譜柱 |
| 流動相使用不當或緩沖鹽的結(jié)晶沉淀 | a．使用恰當?shù)牧鲃酉郻．沖洗色譜柱 |
| 色譜柱選擇不當 | 選擇恰當?shù)纳V柱 |
| 進樣閥堵塞 | 清洗或更換進樣閥 |
| 柱溫過低 | 提高溫度 |
| 控制器失常 | 修理或更換控制器 |
| 保護柱阻塞 | 清洗或更換保護柱 |
| 在線過濾器阻塞 | 清洗或更換在線過濾器 |
D、壓力持續(xù)偏低??????????????????????????????????????????????????表4
| 原因 | 解決方法 |
| 流速設(shè)定過低 | 調(diào)整流速 |
| 系統(tǒng)漏液 | 確定漏液位置并維修 |
| 色譜柱選擇不當 | 選擇恰當?shù)纳V柱 |
| 柱溫過高 | 降低溫度 |
| 控制器失常 | 維修或更換控制器 |
E、壓力不斷上升
| 原因 | 解決方法 |
| 見表3 | 見表3 |
F、壓力降為零
| 原因 | 解決方法 |
| 見表1和2 | 見表1和2 |
G、壓力不斷下降，但不回零
| 原因 | 解決方法 |
| 見表4 | 見表4 |
H、壓力波動
| 原因 | 解決方法 |
| 泵中有氣體 | a. 溶劑脫氣b. 從泵中除去氣體 |
| 單向閥損壞 | 更換單向閥 |
| 泵密封損壞 | 更換泵密封 |
| 脫氣不充分 | a. 溶劑脫氣b. 改脫氣方法(使用在線脫氣法等) |
| 系統(tǒng)漏液 | 確定漏液位置并維修 |
| 使用梯度洗脫 | 由于流動相粘度的變化引起的壓力波動是正常的 |
第三章、常見問題之漏液
通常漏液問題可以靠擰緊或更換管路接頭來解決，但值得注意的是過度擰緊會導(dǎo)致 金屬接頭的漏液和塑料接頭的磨損。如果通過稍微擰緊接頭不能解決漏液，就必須 將接頭取下，檢查是否損壞(例如：卡套損壞、密封表面有雜質(zhì))；損壞的接頭應(yīng)該更換掉。
A、接頭處漏液
| 原因 | 解決方法 |
| 接頭松動 | 擰緊 |
| 接頭磨損 | 更換 |
| 接頭過緊 | a.?????? 擰松，再重新擰緊b.????? 更換接頭 |
| 接頭被污染 | a. 拆下清洗b. 更換接頭 |
| 部件不匹配 | 使用同一品牌的配件 |
B、泵漏液
| 原因 | 解決方法 |
| 單向閥松動 | a. 擰緊單向閥(不必擰得過緊)b. 更換單向閥 |
| 接頭松動 | 擰緊接頭(不必擰得過緊) |
| 混合器密封損壞 | a. 更換混合器密封b. 更換混合器 |
| 泵密封損壞 | 維修或更換泵密封件 |
| 壓力傳感器損壞 | 維修或更換壓力傳感器 |
| 脈沖阻尼器損壞 | 更換脈沖阻尼器 |
| 比例閥損壞 | a. 檢查隔膜，如果漏液立即更換b. 檢查手緊接頭，如果損壞立即更換 |
| 放空閥損壞 | a. 擰緊放空閥b. 更換放空閥 |
C、進樣閥漏液
| 原因 | 解決方法 |
| 轉(zhuǎn)子密封損壞 | 重新安裝或更換進樣閥 |
| 定量環(huán)阻塞 | 更換定量環(huán) |
| 進樣口密封松動 | 調(diào)整 |
| 進樣針頭尺寸不合適 | 使用恰當?shù)倪M樣針 |
| 廢液管阻塞 | 更換廢液管 |
| 廢液管中產(chǎn)生虹吸 | 保持廢液管高于廢液液面 |
D、色譜柱漏液
| 原因 | 解決方法 |
| 尾端接頭松動 | 擰緊接頭 |
| 卡套內(nèi)有填料 | 拆下、清洗卡套、重新安裝 |
| 篩板厚度不合適 | 使用合適的篩板(參考下表) |
篩板選擇指南
| 填料粒徑 | 篩板孔徑 |
| 2-4um | 0.5um |
| 5-20um | 2um |
E、檢測器漏液
| 原因 | 解決方法 |
| 流通池墊片損壞 | a. 避免過大的背壓b. 更換墊片 |
| 流通池窗破碎 | 更換窗片 |
| 手緊接頭漏液 | 擰緊或更換 |
| 廢液管阻塞 | 更換廢液管 |
| 流通池阻塞 | 重新安裝或更換 |
第四章、常見問題之譜圖問題
液相色譜系統(tǒng)的許多問題都能在譜圖上反映出來，其中有一些問題可以通過改變設(shè) 備參數(shù)得到解決，而其它問題必須通過修改方法來解決問題。選擇正確色譜柱和流 動相是得到好的色譜圖的關(guān)鍵。
A、峰拖尾
| 原因 | 解決方法 |
| 篩板阻塞 | a. 反沖色譜柱b. 更換進樣口篩板
c. 更換色譜柱 |
| 色譜柱塌陷 | 填充色譜柱/更換色譜柱 |
| 干擾峰 | a. 使用更長的色譜柱b. 改變流動相/或更換色譜柱 |
| 流動相pH選擇錯誤 | 調(diào)整pH值，對于堿性化合物的分離，低pH值可使峰形更對稱 |
| 樣品與填料的活性位點發(fā)生反應(yīng) | a.?????? 加入離子對試劑或揮發(fā)性堿性改性劑
b. 更改色譜柱 |
B、峰前延
| 原因 | 解決方法 |
| 柱溫低 | 升高柱溫 |
| 樣品溶劑選擇不恰當 | 使用流動相作為樣品溶劑 |
| 樣品過載 | 降低樣品含量 |
| 色譜柱損壞 | 反沖或更換色譜柱 |
C、峰裂分
| 原因 | 解決方法 |
| 保護柱或分析柱進樣口污染 | 取下保護柱再分析：若有需要，應(yīng)更換保護柱
若是分析柱進樣口堵塞，拆下來清洗。 如果分析柱阻塞，可以反沖色譜柱。 如果問題仍然存在，可能是色譜柱被強 保留物質(zhì)污染，可運行適當?shù)脑偕?/p> 施。如果仍不能解決問題，可能是進樣 口堵塞，可以更換篩板或色譜柱。 |
| 樣品溶劑不溶于流動相 | 改變樣品溶劑。如果可能，使用流動相為樣品溶劑。 |
D、大峰變形
| 原因 | 解決方法 |
| 樣品過載 | 減少進樣量 |
E、較早洗脫峰變形
| 原因 | 解決方法 |
| 樣品溶劑選擇不恰當 | a. 減少進樣體積b. 用更弱的溶劑 |
F、較早洗脫出的峰拖尾程度大于較晚洗脫出的峰
| 原因 | 解決方法 |
| 柱外效應(yīng) | a.??????? 調(diào)整系統(tǒng)連(使用更短、內(nèi)徑更小的管路)
b. 使用小體積的流通池 |
G、容量因子(k’)增加時，拖尾更嚴重
| 原因 | 解決方法 |
| 二級保留效應(yīng)，反相模式 | a.?????? 加入三乙胺(堿性樣品)b.????? 加入乙酸(酸性樣品)
c.?????? 加入鹽或緩沖劑(離子型樣品) d.????? 更換色譜柱 |
| 二級保留效應(yīng)，正相模式 | a.?????? 加入三乙胺(堿性樣品)b.????? 加入乙酸(酸性樣品)
c.?????? 加入水（多官能團化合物），僅適 用于使用水溶性流動相的正相方法 d. 試用另一種液相色譜方法 |
| 二級保留效應(yīng)，離子對 | 加入三乙胺(堿性樣品) |
H、酸性或堿性化合物的峰拖尾
| 原因 | 解決方法 |
| 緩沖液不合適 | a.?????? 使用濃度50-100mM的緩沖液b.????? 使用與流動相pH值相等pKa的緩
沖液 |
I、額外的峰
| 原因 | 解決方法 |
| 樣品中有其他化合物 | 正常 |
| 前一次進樣未洗脫出的峰 | a.?????? 增加運行時間或梯度斜率b.????? 提高流速 |
| 空缺或鬼峰（購買專門的鬼峰消除小柱，解決鬼峰問題）點擊這里獲取鬼峰柱信息 | a.?????? 檢查流動相是否純凈b.????? 使用流動相作為樣品溶劑
c.?????? 減少進樣體積 |
| 污染 | 過濾樣品 |
J、保留時間改變（保留時間在5%左右波動一般被視為正常）
| 原因 | 解決方法 |
| 溫控不當 | 維持柱溫不變 |
| 流動相變化 | 防止變化(蒸發(fā)、反應(yīng)等) |
| 色譜柱平衡不充分 | 在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱 |
K、保留時間突然變化
| 原因 | 解決方法 |
| 流速變化 | 重新設(shè)定流速 |
| 泵中有氣泡 | 從泵中除去氣泡 |
| 流動相選擇不恰當 | a.?????? 更換合適的流動相b.????? 檢查流動相混合器 |
L?、基線漂移
| 原因 | 解決方法 |
| 柱溫波動(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差折光檢測器、電導(dǎo)檢測器或較高靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器) | 控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器 |
| 流動相不均一(基線向上漂移，流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移) | 使用色譜純?nèi)軇⒏呒兌鹊柠}和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用過程中用氦氣 |
| 流通池被污染或有氣體 | 用甲醇或其他強溶劑沖洗流通池，如有需要，可以用1N的硝酸清洗 (不要用鹽酸) |
| 檢測器出口阻塞(高壓造成流通池窗破裂，產(chǎn)生基線噪音) | 清理阻塞物或更換管路。參考檢測器手冊更換流通池窗 |
| 流動相配比不當或變動流速 | 調(diào)整配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速 |
| 柱平衡慢，特別是更換流動相時 | 用中等強度的溶劑進行沖洗，在分析前用10-20倍柱體積的新流動相對柱子進行沖洗 |
| 流動相污染、變質(zhì)或由劣質(zhì)溶劑配成 | 檢查流動相的組成。使用優(yōu)質(zhì)化學試劑及色譜純?nèi)軇?/td> |
| 樣品中有強保留的物質(zhì)(高k’ 值) 以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高基線(梯度分析會使其加劇) | 使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中定期使用強溶劑沖洗柱子 |
| 循環(huán)使用流動相，但檢測器未調(diào)整 | 重新設(shè)定基線。如循環(huán)流動相已超出檢測器檢測范圍，使用新的流動相 |
| 檢測器(UV)沒有設(shè)定在最大吸收波長處 | 將波長調(diào)整至最大吸收波長處 |
M、基線噪音(規(guī)則的)
| 原因 | 解決方法 |
| 在流動相、檢測器或泵中有空氣 | 流動相脫氣，沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣 |
| 漏液 | 見第三章。檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封 |
| 流動相混合不完全 | 用人工配置流動相或使用低粘度的溶劑 |
| 溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱) | 減少差異或使用熱交換器 |
| 在同一條線上有其他電子設(shè)備 | 斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自外部，加以更正 |
| 泵脈沖 | 在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器 |
N、基線噪音(不規(guī)則的)
| 原因 | 解決方法 |
| 漏液 | 見第三章。檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。 檢查檢測器流通池是否漏液 |
| 流動相污染、變質(zhì)或由劣質(zhì)溶劑配成 | 檢查流動相的組成 |
| 流動相溶劑不互溶 | 選擇互溶的流動相 |
| 檢測器/記錄儀電子元件問題 | 斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正 |
| 系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 | 用強溶劑沖洗系統(tǒng) |
| 檢測器內(nèi)有氣泡 | 沖洗檢測器，在檢測器后面安裝背壓調(diào)節(jié)器 |
| 流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音) | 用1N的硝酸(不能用鹽酸)清洗流通池 |
| 檢測器燈能不足 | 更換氘燈 |
| 色譜柱硅膠或填料流失 | 更換色譜柱 |
| 流動相混合不均勻或混合器工作不正常 | 維修或更換混合器，在使用等度模式時，建議離線流動相配制 |
O、寬峰
| 原因 | 解決方法 |
| 變動流動相組成 | 重新配制流動相 |
| 流動相流速太低 | 調(diào)節(jié)流速 |
| 漏液(特別是在柱子和檢測器之間) | 見第三章，檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液、是否有鹽析出和不正常的噪音。如果必要，更換密封 |
| 檢測器設(shè)定不正確 | 調(diào)整設(shè)定 |
| 柱外效應(yīng)a.?????? 柱子過載
b.????? 檢測器響應(yīng)時間過長或流通池體積過大 c.?????? 柱子與檢測器之間的管路太長或管路內(nèi)徑太大 d.????? 記錄儀響應(yīng)時間太長 |
a.?????? 減少上樣量(如10μL vs. 100μL) 或1:10和1:100稀釋樣品b.????? 減少響應(yīng)時間或使用更小的流通池
c.?????? 使用內(nèi)徑為0.005 – 0.007英寸的較短管路 d.????? 減少響應(yīng)時間 |
| 緩沖液濃度太低 | 增加濃度 |
| 保護柱污染或失效 | 更換保護柱 |
| 色譜柱污染或失效，塔板數(shù)較低 | 更換同樣類型的色譜柱 |
| 柱入口塌陷 | 更換柱子 |
| 洗脫出的峰含有兩個或多個未被完全分離的化合物 | 選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果 |
| 柱溫過低 | 提高柱溫。除非色譜柱制造商注明，否則溫度不宜超過60°C |
| 檢測器時間常數(shù)太大 | 使用較小的時間常數(shù) |
P、分離度低
| 原因 | 解決方法 |
| 流動相污染或變質(zhì)(引起保留時間變化) | 重新配制流動相 |
| 保護柱或分析柱阻塞 | 取下保護柱再分析，如需要可更換保護柱，若是分析柱堵塞，可反沖色譜柱，如果問題仍然存在，可能是柱子被強保留物污染，可運用適當?shù)脑偕胧?，若還不行，可能是入口處堵塞，可以更換篩板或色譜柱 |
Q、所有的峰面積都太小
| 原因 | 解決方法 |
| 檢測器衰減設(shè)定過高 | 降低衰減設(shè)定 |
| 檢測器時間常數(shù)設(shè)定太大 | 設(shè)定較小的時間常數(shù) |
| 進樣量過低 | a.?????? 增加樣品濃度b.????? 如果柱規(guī)格允許，增大進樣量 |
| 記錄儀連接不當 | 正確連接記錄儀 |
R、所有的峰面積都太大
| 原因 | 解決方法 |
| 檢測器衰減設(shè)定過低 | 提高衰減設(shè)定 |
| 進樣量過高 | a.?????? 降低樣品濃度b.????? 減少進樣量，使用更小的樣品定量環(huán)或部分定量環(huán)進樣 |
| 記錄儀連接不當 | 正確連接記錄儀 |
第五章、進樣閥的問題
以下問題在使用進樣閥過程中有可能產(chǎn)生。
進樣閥漏液問題及其解決方法已經(jīng)在第三章介紹過。
A、手動進樣閥，轉(zhuǎn)動不靈
| 原因 | 解決方法 |
| 轉(zhuǎn)子密封損壞 | 更換或調(diào)整轉(zhuǎn)子密封 |
| 轉(zhuǎn)子太緊 | 調(diào)整轉(zhuǎn)子的松緊度 |
B、手動進樣閥，進樣困難
| 原因 | 解決方法 |
| 進樣閥安裝不當 | 重新安裝 |
| 定量環(huán)阻塞 | 更換定量環(huán) |
| 進樣針污染 | 清洗或更換進樣針 |
| 管路阻塞 | 清洗或更換管路 |
C、自動進樣閥，不能轉(zhuǎn)動
| 原因 | 解決方法 |
| 無氣壓(或電源) | 提供恰當?shù)膲毫?電源) |
| 轉(zhuǎn)子太緊 | 調(diào)整轉(zhuǎn)子的松緊度 |
| 進樣閥安裝不當 | 重新安裝 |
D、自動進樣閥，其它問題
| 原因 | 解決方法 |
| 阻塞 | 清洗或更換阻塞部件 |
| 機械故障 | 見隨機維修手冊 |
| 控制器故障 | 維修或更換控制器 |
第六章、常見故障及日常預(yù)防維護
下表中列出了液相色譜操作中常見的一些問題，右側(cè)中則列出日常維護的方法以減 少問題出現(xiàn)的頻率。 儀器自帶的用戶手冊則提供您更多的維護方法。
A、溶劑瓶
| 原因 | 預(yù)防維護 |
| 入口過濾器阻塞 | a.?????? 更換(每3-6個月)b.????? 過濾流動相，0.5μm濾膜 |
| 氣泡 | 流動相脫氣 |
B、泵
| 原因 | 預(yù)防維護 |
| 氣泡 | 流動相脫氣 |
| 泵密封損壞 | 更換(每3個月) |
| 單向閥損壞 | 過濾流動相、使用入口過濾器，準備備用單向閥 |
C、進樣閥
| 原因 | 預(yù)防維護 |
| 轉(zhuǎn)子密封損壞 | a.?????? 不要擰的過緊b.????? 過濾樣品 |
D、色譜柱
| 原因 | 預(yù)防維護 |
| 篩板阻塞 | a.?????? 過濾流動相b.????? 過濾樣品
c.?????? 使用在線過濾器或保護柱 |
| 柱頭塌陷 | a.?????? 避免使用pH>8的流動相 (針對大部分硅膠的色譜柱)
b.????? 使用保護柱 c.?????? 使用預(yù)柱(飽和色譜柱) |
E、檢測器
| 原因 | 預(yù)防維護 |
| 氘燈失效，檢測器響應(yīng)降低，噪音擴大 | 更換(每6個月)或準備備用燈 |
| 流通池有氣泡 | a.?????? 保持流通池清潔b.????? 池后使用反壓抑制器
c.?????? 流動相脫氣 |
特別提示：污染物會導(dǎo)致下列問題
???背壓升高
??峰裂分
??峰展寬
??基線噪音
??基線漂移
??分離度降低
??色譜柱的永久損壞
???系統(tǒng)損壞
建議使用HPLC保護柱來保護您的HPLC色譜柱和結(jié)果，點擊這里獲取保護柱信息。
